以家蠶作為生物反應器生產Pleurocidin抗菌蛋白之研發發佈日期：2024/01/02
實施期間起迄
113年01月02日~113年12月31日執行單位
中原大學生物科技學系 吳宗遠教授執行成果
摘要:Pleurocidin 是一種有效的抗菌蛋白(antimicrobial peptide, AMP)，由25個胺基酸所構成的胜肽，是自比目魚winter flounder (Pleuronectes americanus)之皮囊分泌黏液（skin mucus secretions）所分離出。先前的研究顯示pleurocidin具有廣效性的抗菌效果（broad-spectrum antimicrobial activity），可抗多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌，還可殺死癌細胞，對哺乳動物細胞無細胞毒性，溶血活性低。對水產類重要的病原菌如鰻弧菌Vibrio anguillarum 、鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida 及病毒性出血性敗血症(VHSV)等抑制效果良好，被認為在水產養殖的應用上可能較常用的抗菌藥物gramicidin S和polymyxin B有更好的經濟效益。且pleurocidin蛋白具有耐熱、耐高鹽等特性有利於產品商業化加工、儲存、運輸作業，將可用於水產養殖、畜產、寵物等飼料添加應用，以取代抗生素。然則，不論是直接自比目魚分離純化或是以胜肽合成之方式，皆因成本太高而不適用於商業化的產量開發。因此借助基因工程技術建立此抗菌胜肽之大量表現系統為一重要之課題。
先前的研究結果顯示，當以酵母菌Pichia pastoris為宿主系統進行pleurocidin之cDNA的表現時，卻無法得到足夠量的蛋白質以進行簡易之生化分析，如SDS-PAGE或Western blot，顯示酵母菌並不適於作為此具商業潛能之抗菌蛋白的表現系統，是故我們想測試利用桿狀病毒表現系統（Baculovirus expression system）於家蠶中來進行比目魚抗菌蛋白pleurocidin大量生產的可行性。我們目前已完成1. pleurocidin抗菌蛋白的基因合成:因為pleurocidin抗菌蛋白的大小僅為25個胺基酸所構成的胜肽，因此不易表現。為了解決pleurocidin抗菌蛋白不易表現的問題，我們引入DsRed-2A序列並將pleurocidin抗菌蛋白的DNA序列 in-frame接入DsRed-2A的3’端而合成DsRed-2A-pleurocidin基因序列。考量未來將以家蠶蟲體作為生物反應器，因此我們將以BmNPV桿狀病毒作為表現的載體系統而非習知的AcMNPV, 所以我們也成功的2、建立家蠶細胞的培養系統。建立家蠶細胞的培養系統後我們將帶有DsRed-2A-pleurocidin基因序列的傳送載體於家蠶細胞中進行同源重組(homologus recombination)並3. 已成功至備含pleurocidin抗菌蛋白基因的BmNPV重組桿狀病毒。
研究策略:
利用桿狀病毒表現系統（Baculovirus expression system）於家蠶中來大量生產比目魚抗菌蛋白pleurocidin
研究成果：
1. pleurocidin抗菌蛋白的基因合成與表現設計:因為pleurocidin抗菌蛋白的大小僅為25個胺基酸所構成的胜肽，因此不易表現。為了解決pleurocidin抗菌蛋白不易表現的問題，我們引入DsRed-2A序列並將pleurocidin抗菌蛋白的DNA序列 in-frame接入DsRed-2A的3’端而合成DsRed-2A-pleurocidin基因序列。
2.建立家蠶細胞的培養系統:建立家蠶細胞的培養系統後我們將帶有DsRed-2A-pleurocidin基因序列的傳送載體於家蠶細胞中進行同源重組(homologus recombination)並挑選出正確的重組桿狀病毒
3. 進行利用紅螢光蛋白抗體確認pleurocidin抗菌蛋白的表現分析
